目的基因的分离方法主要有哪些

作为目的基因，其表达产物应该有较大的经济效益或社会效益，如那些特效药物相关的基因和降解毒物相关的基因等。
但是那些表达产物有害的基因，也不是绝对不能作为目的基因，往往在特殊需要的情况下也作为目的基因进行使用，如毒素基因等。选用什么样的目的基因是基因工程设计必须优先考虑的问题，如何分离获得目的基因是基因工程操作的重要技术之一。
目前，目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基因组，特别是人和动植物染色体基因组中蕴藏着大量的基因，是获得目的基因的主要来源。虽然原核生物的染色体基因组比较简单，但也有几百、上千个基因，也是目的基因来源的候选者。此外，质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组也有少量的基因，往往也可从中获得目的基因。
根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个基因编码区，或者包含启动子和终止子的功能基因；可能是一个完整的操纵子，或者由几个功能基因、几个操纵子聚集在一起的基因簇；也可能只是一个基因的编码序列，甚至是启动子或终止子等元件。而且不同基因的大小和组成也各不相同，因此获得目的基因有多种方法。目前采用的方法主要有酶切直接分离法、构建基因组文库或cDNA文库分离法、PCR扩增法和化学合成法等。

1.从生物基因组群体中分离目的基因
原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。



图10-3-1 限制性内切酶

限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种限制酶，都有自己特定的作用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构（palindromes）。例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。多在原核生物中存在，能识别4～6个特苷酸特定的碱基序列。限制酶对细菌有保护作用，某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因此而得名。限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保护之故。

这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比较大的基因组，可以先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。

2.人工合成目的基因DNA片段
人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。

3.PCR反应合成DNA
聚合酶链式反应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。PCR技术的原理如下：



图10-3-2 PCR原理图

（1）以混合的 DNA 片段作模板，例如，可以用 cDNA 基因文库做模板，在 90℃ 高温下，作为模板的双链 DNA 均变性，分开成为单链DNA。
（2）在反应体系中以有两种合成的 DNA 小段寡聚核苷酸做引物，这两种寡核苷酸应可以分别和特异 DNA 片段的正链的 3'末端与负链的 3'末端相结合。寡核苷酸引物要在 50℃ 的温度下，才能较好的找到可以配对的正链和负链，形成互补结合。显然，在混合 DNA 片段作模板的情况下，只有可以形成配对关系的 DNA 链才可特异性地结合引物寡核苷酸。这个过程又称为淬火。
（3）反应体系中还有高温 DNA 聚合酶，以及作为原材料的四种脱氧核苷三磷酸（4 X dNTP) 。高温 DNA 聚合酶来自一种特殊的耐高温细菌，俗称 Taq 酶。在 70℃ 高温下，经 Taq 酶催化，以四种脱氧核苷三磷酸为原料，在形成互补的引物寡核苷酸后，迅速合成一条与模板 DNA 单链（正链或负链）互补结合的DNA新链。
（4）以上三个步骤周而复始，即反应体系的温度从 90oC- 50oC- 75oC，反应体系中经历：变性（ DNA 双链变性生成单链）——淬火（寡核酸引物和特异的 DNA 模板结合，配对）——合成（以引物为起点，合成与模板互补的 DNA 新链）。每次循环约需6-10分钟。经过20次循环，能与引物特异结合的那段 DNA ——即需要放大增殖目的 DNA 分子，可以扩增106倍。

4.mRNA差异显示法获得目的基因
mRNA差异显示(mRNA differential display, DD)是1992年由哈佛医学院Peng Liang等人建立的。原理是先用PCR技术扩增所有的mRNA、生成cDNA群体，再用测序凝胶电泳获取所需要的目的基因，然后再次用PCR扩增。简单的讲，就是从基因的转录产物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因。

5、用机械的方法，例如超声波把基因组打成片段。

15092689608：基因都是怎么提纯的?
屈超希 ：答：一.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb 二.甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。三.玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩...

15092689608：分离DNA和RNA主要方法有哪些
屈超希 ：答：[思路分析]：①取鸡血细胞液（其红细胞椭圆具核,除骆驼外,猪、羊、狗等哺乳动物红细胞无核）,或取新鲜猪肝、菜花、洋葱等材料.虽然在细菌的转化实验中提取的是无核细胞中的DNA,但一般而言,均是从具核的生物材料中提取DNA.当然,在提取出的DNA中也含有一定量的胞质DNA,即线粒体DNA和叶绿体DNA.值得...

15092689608：分离DNA和RNA主要方法有哪些
屈超希 ：答：：①取鸡血细胞液（其红细胞椭圆具核,除骆驼外,猪、羊、狗等哺乳动物红细胞无核）,或取新鲜猪肝、菜花、洋葱等材料.虽然在细菌的转化实验中提取的是无核细胞中的DNA,但一般而言,均是从具核的生物材料中提取DNA.当然,在提取出的DNA中也含有一定量的胞质DNA,即线粒体DNA和叶绿体DNA.值得推介的材料...

15092689608：目的基因的分离方法主要有哪些
屈超希 ：答：直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞...

15092689608：植物发育基因分离的方法有哪些?
屈超希 ：答：1 做一些转录谱或者蛋白谱的分析，找到在特定发育阶段特异表达的基因；常见的有 SSH（差减抑制杂交）；比较蛋白组学；转录组测序等。拿到这些相关基因后，做一些转基因验证，证实该基因是否参与该发育过程；2 诱变筛选出，发育缺陷的植株。然后图位克隆，将影响该缺陷的基因定位到染色体上特定的部位，然后...

15092689608：目的基因分离最常用的方法及原理? 急急急
屈超希 ：答：1.从生物基因组群体中分离目的基因 原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。图10-3-1 限制性内切酶 限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解...

15092689608：提取基因组DNA的方法有哪些?各有何优缺点?
屈超希 ：答：3、磁珠法 磁珠法是纳米科技与生物技术的完美结合，具有其他DNA提取方法无法比拟的优势，主要体现在：（1）能够实现自动化、高通量操作，配合96孔的核酸自动提取仪，在以往做一个样品的提取时间内可同时实现对96个样品的处理，效率直接提高96倍，满足了当前生物学高通量操作的要求，使得在大规模疫情爆发时...

15092689608：基因分离定律3种验证方法:1测交法2自交法3花粉鉴定法的过程
屈超希 ：答：观察子代表现型分离比，应为1：1.2、自交法：将杂种子一代进行自交得子二代，子二代表现型分离比应为3:1.3、花粉鉴定法：有的植物花粉中存在淀粉，而含等位基因的花粉中则没有。利用碘与花粉中淀粉反应显色的现象，来计数变蓝与不变蓝的花粉数量。其比例应为1:1 ...

15092689608：目的基因要怎样分离?
屈超希 ：答：或者由几个功能基因、几个操纵子聚集在一起的基因簇；也可能只是一个基因的编码序列，甚至是启动子或终止子等元件。而且不同基因的大小和组成也各不相同，因此获得目的基因有多种方法。目前采用的方法主要有酶切直接分离法、构建基因组文库或cDNA文库分离法、PCR扩增法和化学合成法等。

15092689608：基因组DNA文库要怎样分离目的基因?
屈超希 ：答：构建高等植物基因组DNA文库时，通常采用λ噬菌体载体和黏粒载体。基因文库构建后，从文库中筛选基因的方法主要有核酸杂交法、免疫学检测法、DNA同胞选择法、PCR筛选法等。应用λ噬菌体载体构建基因组DNA文库的一般操作程序主要包括（link：xlinkhref=i011902图4-20link）：（1）用适当的限制性内切酶消化基因...