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免疫球蛋白提取实验注意事项及原因

来源:www.zuowenzhai.com    作者:编辑   日期:2024-06-01
生产免疫球蛋白的原料是从哪里得到的?

我国在2006年4月11日,卫生部会同国家食品药品监督管理局等9部委共同制定了《关于单采血浆站转制的工作方案》,该方案规定,将原来由县级卫生行政部门设置的单采血浆站转制为由血液制品生产企业设置,血浆站与血液制品生产企业建立“一对一”的供浆关系。简单来说,就是血浆站归血液制品生产企业所有,自行采浆,国家有关部门执行监督职能。人免疫球蛋白就是由这些企业血浆站所采集的血浆生产而来。

人们把存在于血液和其它体液中具有免疫活性的一类蛋白质称为抗体,又叫免疫球蛋白或丙种球蛋白,它是从健康人血或胚胎血中提取出来的,这种制剂称为胎盘血或人血丙种球蛋白。它含有麻疹、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、白喉、破伤风等多种疾病的抗体。
球蛋白有两种:丙种球蛋白和胎盘球蛋白。

丙种球蛋白是从健康人的血液中提取的。丙种球蛋白又称抗体,是健康人在和疾病作斗争的过程中产生的。

胎盘球蛋白是从健康产妇的胎盘中提取制成的,其主要成分是丙种球蛋白。球蛋白可以增强人体抵抗疾病的能力,属于人工被动免疫制剂。

IgG的分离与提纯

(一)材料与试剂配制
1.动物血清
2.硫酸铵饱和溶液
硫酸铵 800g~850g
H2O 1 000ml
加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%NH4OH调pH至7.0(不调pH值也可以)。
注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可。
3.0.01Mol/L pH7.4PB液
A液:0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4•2H2O 15.60g
加H2O至 1 000.ml
B液:0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4•12H2O 35.80g
加H2O至 1 000ml
取A液19ml,B液81ml加水至1 000ml即可。
4.1%BaCl2溶液
5.纳氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至 500.00ml
溶化后过滤,然后再加20%NaOH500.00ml,混合即可。
6.0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
7.洗脱液:0.03Mol/L的NaCl液。
8.透析袋(或玻璃纸)。
(二)操作方法
1.取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。
2.3 000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。
3.在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。
4.3 000r/min离心20min,弃上清。
5.于沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min。
6. 3 000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2~3次。
7. 用10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。
8. 透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24h,中间换液数次。
以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+(取3~4ml透析液,加试剂1~2滴,出现砖红色即认为有NH4+存在),直至无 SO42-或NH4+出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
9. 离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。
10.过DEAE-纤维素层析柱。(装柱过程见层析技术)。以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液。
也可采用SephadexG150或G200柱。
11.蛋白质及其定量鉴定(见本章第八节)。
12.IgG的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定。
⑴ 区带电泳:玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度(NH4)2SO4盐析样品进行电泳,以资比较。
⑵ 琼脂双相双扩散鉴定:预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。
⑶ 免疫电泳鉴定:(操作见第三章免疫电泳部分)。孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。
⑷ 圆盘电泳鉴定:用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则只有一条区带。
13.IgG的浓缩与保存
⑴ IgG的浓缩:参看本章第九节。
⑵ IgG的保存:一般浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融。
(三)IgG的简易快速提取法
应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG,不仅操作复杂、需时较长,处理过程中样品体积大大增加,而且透析时变性严重,容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足,特别是当大量提取IgG时,则往往采取下列的简易办法。
1. DEAE-纤维素直接提取法
取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。
⑴ 以一定数量的DEAE52放入烧杯中,加入0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液,静置30min,去上清细粒,再重复一次。
⑵用布氏漏斗(内放两层滤纸)过滤。
⑶以5g湿重的DEAE-纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例,加入各成分,充分搅拌。
⑷于4℃中放置1h,中间搅拌数次。
⑸用布氏漏斗抽滤,再用0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液冲洗纤维素,抽滤。滤液即为提取的IgG液。
2.DEAE-SephadexA-50为弱碱性阴离子交换剂,经NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白,血清中除γ-G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时,酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附,只有γ-G留在溶液中。因此利用这一原理可以提取γ-G。这种提取法流程大大缩短,纯化前后样品体积变化不大,而且所得γ-G无变性现象。经过四次处理,其纯度也较好。缺点是收集量少,损耗大。
⑴ DEAE—SephadexA—50的处理。取DEAE-SephadexA-50若干克,悬浮于蒸馏水中,1h后倾去上层小颗粒,然后用0.50Mol/L NaOH处理1h,蒸馏水洗至中性,再用0.5 Mol/L HCl处理0.5h,水洗至中性,最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
⑵ 取一定的血清量,加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液,再加液体体积1/4的滤干的DEAE-SephadexA-50,混合、4℃放置1h,不时搅拌、抽滤、收集滤液。
⑶ 再用同样重量的DEAE-SephadexA-50处理滤液。反复处理三次。(全程共四次)。获得滤液即为γ-G制品。
⑷ DEAE-SephadexA-50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱,抽滤至滤液中无蛋白(OD280﹤0.04)后,再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。


13312421731免疫球蛋白提取实验注意事项及原因
汲若砖答:⑶ 免疫电泳鉴定:(操作见第三章免疫电泳部分)。孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。⑷ 圆盘电泳鉴定:用全血清样品及提纯...

13312421731分离纯化免疫球蛋白为什么尽可在低温条件下进行?所用溶液为何要先冷却...
汲若砖答:常温下蛋白易降解,低温可以保持其活性;抗体对温度比较敏感,长时间暴露在室温下可以使抗体失活,因此提取免疫球蛋白最好在低温下进行。(摘自网络)溶液提前冷却也是为了保持低温环境,否则降温过程中抗体也可能因为温度高而失活。

13312421731免疫球蛋白是怎么提取?
汲若砖答:1、收集动物血浆:可以从动物如兔子、鼠等的血浆中获得大量的免疫球蛋白。2、细胞培养技术:通过将免疫细胞(如淋巴细胞)与特定的抗原刺激并体外培养,让其分泌免疫球蛋白。3、蛋白A或蛋白G亲和层析技术:这种方法利用免疫球蛋白与蛋白A或蛋白G之间的高度特异性反应,从血清或其他来源中纯化免疫球蛋白。4...

13312421731破伤风免疫球蛋白的注意事项
汲若砖答:1.冻干制剂重溶后应为澄明或可带乳光液体。如有摇不散的沉淀或异物不可使用。液体制剂久存可能出现微量沉淀,但一经摇动应立即消散。2 .安瓿打开后,制品应一次注射完毕,不得分次使用。

13312421731如何用实验证明抗体是免疫球蛋白?求技术帝!给个大概的思路也好~_百度...
汲若砖答:做一下免疫球蛋白电泳实验吧: 免疫电泳—免疫球蛋白鉴定 免疫电泳是将电泳与双向琼脂扩散相结合的一种抗原分析方法.根据抗原中各蛋白质组分的电荷和分子量大小不同,在电场作用下有不同的迁移率,从而可将混合物中各种不同组分分开.实验时,将被检抗原样品先放在琼脂板的小孔中进行电泳分离,再在其平行...

13312421731...蛋白的具体方法(包括原理,步骤,预期结果,注意事项)谢谢
汲若砖答:(5)鉴定――乙酸纤维素薄膜电泳 取乙酸纤维素薄膜2条,分别将血清、脱盐后的球蛋白、DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的γ-球蛋白液等样品点上。然后参阅实验二十四:乙酸纤维薄膜电泳法进行电泳分离、染色。比较电泳结果。 [注意事项] (1)凝胶及DEAE纤维处理期间,必须小心用倾泻法除去细小颗粒。这样可使凝胶及纤维素颗粒...

13312421731狂犬病免疫球蛋白的注意事项
汲若砖答:安瓿启开溶解后,应一次注射完毕,不得分次使用。如安瓿破裂、瓶签不清楚或溶解后制品混浊、或有摇不散的沉淀或异物等,均不得使用。不良反应:一般无过敏反应。

13312421731测定小鼠免疫球蛋白的elisa试剂盒哪种效果好
汲若砖答:小鼠总免疫球蛋白EELISA 试剂盒注意事项:1 实验应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀释过后的标准品应丢弃,不可保存 2 实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。3 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。4 使用一次性的吸头以免...

13312421731请设计试验,利用基因工程手段表达并分离小鼠免疫球蛋白。
汲若砖答:2、从菌液中提取质粒,经双酶切回收目的片段,与经同样酶切的原核表达载体连接,再经酶切鉴定及序列分析证实已成功构建融合表达载体。3、将重组原核表达载体转化入大肠杆菌,用SDS-PAGE处理后免疫球蛋白主要以可溶性形式存在于上清液中,收集上清液,分离纯化,后用洗脱液洗脱目的蛋白,透析除盐得到较高纯度...

13312421731乙肝免疫球蛋白的注意事项
汲若砖答:(2)预防特殊情况下的乙肝病毒感染:乙肝易感者在某种场合意外地遇到乙肝病毒感染的危险时,可以单独使用乙肝免疫球蛋白。例如医生、护士和检验人员等在给乙肝表面抗原携带者作治疗、护理或取血检验过程中,不慎手指被针尖刺破,或被手术刀割伤,病人带有乙肝病毒的血液就可以通过皮肤创伤进入上述人员的体内。


(编辑:谈鸿力)
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