免疫荧光双标两种一抗可以一起加吗
一般来说,选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：
1.二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源;
2.二抗需与一抗的类别或亚类相匹配.这通常是针对单克隆抗体而言.多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体;
3.一般来说,不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系,来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别.然而在一些特殊的实验里, 如双标实验里,如果其中一个一抗是山羊来源的,一个是小鼠来源的,则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗,这时候,二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的.
细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
第二天：
6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
一抗种属不同的情况下，免疫荧光双标两种一抗可以一起加：
容易起交叉反应的是二抗，因为二抗会对IGG有反应。而一抗是针对特异蛋白表位的。并不是针对IGG的。
免疫荧光实验方法（连续双标法）
石蜡切片
1)烘片
▷在60℃烘箱放置2-4小时，使蜡流失。
2)脱蜡、脱水
▷二甲苯溶液中脱蜡，2次，每次5min
▷100%乙醇，2次，每次3min
▷95%乙醇，1次，每次3min
▷90%乙醇，1次，每次3min
▷85%乙醇，1次，每次3min
▷H2O，1次，每次3min
3)固定
▷样本切片在冰的甲醇中放置10min (甲醇溶液在-80℃预冷)
▷用冰的PBS溶液洗2次，每次3min (PBS溶液在-20℃短暂预冷)
4)透化
▷用含0.25%Triton X-100的PBS孵育石蜡切片10min (200mlPBS+500ul Triton X-100)
▷用PBS溶液洗3次，每次5min
5)第一荧光标记
▷用PBST配置1%的BSA封闭液，将切片在封闭液中孵育1h
▷4℃冰箱，一抗过夜
▷用枪吸走一抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min
▷二抗室温1h
▷用枪吸走二抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min（避光条件下进行）
6)第二荧光标记
▷4℃冰箱，一抗过夜
▷用枪吸走一抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min
▷二抗室温1h
▷用枪吸走二抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min（避光条件下进行） 7)DAPI对比染色
▷2µg/ml的DAPI，15min
▷用PBS冲洗3次
8)封片
▷用移液枪吸中性树脂一小滴，盖上盖玻片，用指甲油涂抹边缘，待风干后显微镜照相
17138461701：免疫荧光双标两种一抗可以一起加吗
温苛毓
：答：一抗种属不同的情况下，免疫荧光双标两种一抗可以一起加：容易起交叉反应的是二抗，因为二抗会对IGG有反应。而一抗是针对特异蛋白表位的。并不是针对IGG的。免疫荧光实验方法（连续双标法）石蜡切片 1)烘片 ▷在60℃烘箱放置2-4小时，使蜡流失。2)脱蜡、脱水 ▷二甲苯溶液中脱蜡，2次...
17138461701：免疫荧光封闭液和一抗可以一起加么
温苛毓
：答：可以。一抗种属顷丛纯不同的情况下，免疫荧光双标两种一抗可以一起加，容易起交叉反应的是二抗，因为二抗会对IGG有反应。
17138461701：求助:细胞膜蛋白免疫荧光染色问题
温苛毓
：答：(1)选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。(2)我的做法是两种一抗（CHI抗体）同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育...
17138461701：请教免疫荧光双标中荧光二抗的选择是否合适??
温苛毓
：答：2.二抗需与一抗的类别或亚类相匹配.这通常是针对单克隆抗体而言.多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体;3.一般来说,不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系,来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别.然而在一些特殊的实验里, 如双标实验里,如果其...
17138461701：免疫双标
温苛毓
：答：这样选抗体是没有问题的。但是你肯定首先要做抗体的特异性检测，做western杂一下总蛋白。至于两个一抗会不会交叉也不是猜就能猜出来的，也要在western时做个对照。如果真怕会交叉，也可以在做间免的时候像western一样strip。其实对于单抗和多抗没什么特别的要求，其实就是第一要识别你的蛋白，另外...
17138461701：荧光双标技术中制备二抗时是否需要两个不同的动物?用同一个动物可以吗...
温苛毓
：答：理论上是可以的 但是效果可能不好
17138461701：荧光双标和共染双标区别
温苛毓
：答：荧光双标和共染双标区别：1、荧光双标，免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子，当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。此方法稍微复杂一些，首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔。B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。2、...
17138461701：免疫组织化学多重标记方法简介
温苛毓
：答：邻片双标法，就像在同一片石蜡切片中进行的时空旅行，通过精确的断面标记和巧妙的切片处理，我们能在同一视野中观察到两种抗原的共存和位置关系，为研究者提供了直观且精准的图像证据。总的来说，免疫组织化学多重标记技术是一门融合了科学与艺术的技艺，每个步骤都是为了揭示生命故事中的细节，每一标记都...
17138461701：ELISA如何选一抗与二抗
温苛毓
：答：二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，艾美捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继...
17138461701：PBS缓冲液洗5分钟*3,是浸泡还是冲洗?
温苛毓
：答：你说的抗体我没用过，我做过的免疫组化是用的拟南芥和贯叶连翘的愈伤组织，自身激发荧光很强,一抗是58K和Pin1，浓度都是1：250稀释的，二抗是FITC和Cy3，1：50和1:250.一抗4度过夜,二抗2小时.我做的是双标,二抗后先BSA洗1遍,再PBS 3遍.背景每次都还好,对照组的背景也不强....
