为什么要在研磨胚轴时加预冷的PH=6的磷酸缓冲液

过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法

【原理】

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与用具】

紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；

【试剂】

0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；

0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。

【方法】

1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。

表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表

管 号
S1
S2
S3

粗酶液(ml)
0.2
0.2
0.2

pH7.8磷酸(ml)
1.5
1.5
1.5

蒸馏水(ml)
1.0
1.0
1.0


25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

3.结果计算：

以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中 A240 = AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；

AS1, AS2—样品管吸光值；

Vt—粗酶提取液总体积（ml）；

V1—测定用粗酶液体积（ml）；

FW—样品鲜重（g）；

0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；

t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

植物组织中的丙二醛(MDA) 在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸(TBA) 产生显色反应,反应产物为粉红色的3,5,5一三甲基恶唑2,4一二酮(Trimet—nine).该物质在539nm波长下有吸收峰.由于硫代巴比妥酸也可与其它物质反应,并在该波长处有吸收,为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响,在丙二醛含量测定时,同时测定600nm下的吸光度,利用539nm与600nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量.
植物组织丙二醛含量测定
植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化,如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等.这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化.近来大量研究表明,植物在逆境胁迫或衰老过程中,细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于活性氧的积累.活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用,造成细胞膜系统的损伤,严重时会导致植物细胞死亡.活性氧包括含氧自由基.自由基是具有未配对价电子的原子或原子团.生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O-2)、羟自由基(OH·)、过氧自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（O21）等.植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶POD和抗坏血酸过氧化物酶(ASA—POD)等是酶促防御系统的重要保护酶,抗坏血酸(ASA)和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂.
丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一,它的产生还能加剧膜的损伤.因此,丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度,也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱.所以在植物衰老生理和抗性生理研究中,丙二醛含量是一个常用指标.
[材料、仪器、药品]
1．材料：植物抗逆性鉴定实验中的四种菠菜样品,即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照.
2．仪器：(1) 分光光度计；(2) 离心机；（3）水浴锅：(4) 天平；(5) 研钵；(6) 剪刀；(7) 5ml刻度离心管；(9) 刻度试管(10ml)；(10) 镊子；(11) 移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱.
3．药品：(1) 0.05mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液；(2) 石英砂；(3) 5％三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸,先用少量蒸馏水溶解,然后定容到100ml；(4) 0.5％硫代巴比妥酸溶液：称取0.5g硫代巴比妥酸,用5％三氯乙酸溶解,定容至100ml,即为0.5％硫代巴比妥酸的5％三氯乙酸溶液.
[方法]
1．丙二醛的提取：取0.5g样品,加入2ml预冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液,加入少量石英砂,在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆,转移到5ml刻度离心试管,将研钵用缓冲液洗净,清洗也移入离心管中,最后用缓冲液定容至5ml.在4500转/min离心10min.上清液即为丙二醛提取液.
2．丙二醛含量测定：吸取2 ml的提取液于刻度试管中,加入0.5％硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml,于沸水浴上加热10min,迅速冷却.于4500转/min离心10min.取上清液于532、600nm波长下,以蒸馏水为空白调透光率100%,测定吸光度.
3．结果计算：
(A532—A600) ×V1×V
1.55×10-1×W×V2
丙二醛含量（nmol/g）=
式中：A为吸光度；V1为反应液总量(5m1)；V为提取液总量(5ml)；V2为反应液中的提取液数量(2ml)；W为植物样品重量(0.5g)；1.55×10-1为丙二醛的微摩尔吸光系数（在1升溶液中含有1µmol丙二醛时的吸光度）.
4．注意事项：
(1) 0.0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适,若高于此浓度,其反应液的非专一性吸收偏高；
(2) MDA—TBA显色反应的加热时间,最好控制沸水浴10~15min之间.时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降；
(3) 如用MDA作为植物衰老指标,首先应检验被测试材料提取液是否能与TBA反应形成532nm处的吸收峰.否则只测定532、600nm两处A值,计算结果与实际情况不符,测得的高A值是一个假象；
(4) 在有糖类物质干扰条件下(如深度衰老时),吸光度的增大,不再是由于脂质过氧化产物MDA含量的升高,而是水溶性碳水化合物的增加,由此改变了提取液成分,不能再用532nm、600nm两处A值计算MDA含量,可测定510、532、560nm处的A值,用A532一(A510—A560)/2的值来代表丙二醛与TBA反应液的吸光值.

18740938359：为什么要在研磨胚轴时加预冷的PH=6的磷酸缓冲液
孟岩饰 ：答：海德研磨告诉你因为研磨过程中，工件与磨盘之间会因摩擦会产生大量的热，所以要进行冷却。

18740938359：IAA氧化酶活性的测定反应混合液为何加入氯化锰
孟岩饰 ：答：1．将大豆或绿豆种子于30℃温箱中萌发3梍4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶，留下胚轴作材料。2．取0.5g下胚轴，置研钵中，加入预冷的磷酸缓冲液5ml，置冰浴中研磨成匀浆。再按100mg鲜重材料加0.5ml磷酸缓冲液的比例，用磷酸缓冲液洗涤研钵。离心（4000r/min）10分钟，所得上清液即为粗酶液。3...

18740938359：在平面研磨抛光加工中,时间对抛光液PH有没有影响?
孟岩饰 ：答：海德研磨告诉你，时间对抛光液的PH有影响，具体如下：抛光液PH值是抛光元件表面粗糙度的重要影响因素，他是抛光元件化学抛光的重要组成部分。事实证明，当抛光压力、温度等外界因素相匹配时，抛光时的最佳PH值应控制在11.25左右，这时候化学抛光和机械抛光的作用相平衡，抛光效果最佳!抛光液 中PH值参数是...

18740938359：为什么在滴定过程中要加入ph=10的缓冲溶液
孟岩饰 ：答：配位滴定中，必须控制在不同的PH的溶液中进行， 加入缓冲溶液，是调解和控制溶液的PH的。

18740938359：水的总硬度测定为什么要加ph=10的缓冲液
孟岩饰 ：答：加入缓冲液的原因就是为了使滴定过程中能够保持一定的pH值.因为EDTA和钙镁等离子发生络合反应的时候是由ph值的要求的.在缓冲溶液中加入少量的酸、碱，溶液的pH几乎不发生变化。使用缓冲溶液，当然是为了维持溶液的pH在一定的范围内，不使其发生很大的变化。测定水硬度时，需要用氨性缓冲溶液调节pH值。

18740938359：...在研磨叶片时加少许CaCO3的作用是( )A.调节pH,加速叶绿素分解B...
孟岩饰 ：答：A、液泡中细胞液呈酸性，研磨时加入碳酸钙调节pH，防止叶绿素被分解，A错误；B、二氧化硅破坏细胞结构，使研磨充分，B错误；C、碳酸钙可防止研磨过程中叶绿素被破坏，C正确；D、纸层析法可将四种色素分离，D错误．故选：C．

18740938359：...为什么要加入缓冲液,是缓冲细胞研磨破碎后的PH值影响,还是缓冲后来...
孟岩饰 ：答：二者都有。主要是提供一个缓冲环境使dna不被外环境影响。

18740938359：...的缓冲溶液的作用是?EDTA在PH在什么范围会失去络合能力
孟岩饰 ：答：（Y4-在PH>10.26时最稳定）在络合滴定过程中，随着滴定剂与金属离子反应生成相应的络合物，溶液的酸度会逐渐升高，酸度升高不仅会减小MY自身的条件常数，降低反应的完全程度，而且还可能影响指示剂的变色点和自身的颜色，导致终点误差加大，甚至不能准确滴定。使用缓冲溶液就是为了减小溶液PH的变化幅度。

18740938359：为什么在pH=12～13时,要使用钙指示剂?
孟岩饰 ：答：因为钙镁试剂要在这个pH下和Ca2+、Mg2+结合。pH低了的话，钙镁试剂是电中性的，不带电荷，不容易和Ca2+、Mg2+结合。测定Ca2+时，要将溶液的pH控制至12～13，主要是让Mg2+完全生成Mg(OH)2沉淀，以保证准确测定Ca2+的含量；在pH为12～13间钙指示剂与Ca2+形成酒红色配合物,指示剂本身呈纯蓝色，当...

18740938359：培养基25L,ph=4.0,要使ph=7,需要加5mol/L碱液多少克,,可以的话写个详细...
孟岩饰 ：答：答：pH=4.0即[H+]=10^-4moI/l 中和至pH=7，反应离子方程式为:H+十OH-=H2O 25x10^-4÷5=5x10^-4I=0.5mI 需要0.5moI/l的碱液0.5mI，若碱液的密度为1g/mI，那需要碱液0.5克。(望采纳)