苦参碱的实验室分析

苦参碱
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苦参碱是由豆科植物苦参的干燥根、植株、果实经乙醇等有机溶剂提取制成的， 是生物碱。一般为苦参总碱，其主要成分有苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱等多种生物碱，以苦参碱、氧化苦参碱含量最高。其他来源为山豆根及山豆根地上部分，纯品外观为白色粉末。
中文名
苦参碱
外文名
Matrine
外 观
白色粉末
制 成
苦参的干燥根、植株、果实经乙醇
用 途
利尿作用
农业方面
苦参碱是一种植物源农药




CAS号
519-02-8 10236-74-2[1]
EINECS号
209-012-2[1]
分子式
C15H24N2O[1]
分子量
248.37[1]
密 度
1.16g/cm3[1]
熔 点
77 C[1]
沸 点
396.7℃ at 760 mmHg[1]
闪 点
172.7℃[1]
苦参碱的用途
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临床药用
1、利尿作用 苦参作为药用植物，在我国据文字记载已经有两千多年的历史，主要功用具有清热、利尿、杀虫、祛湿等功效，同时还具有抗病毒、抗肿瘤抗过敏等多种作用。
2、抗病原体作用 煎剂在试管中，高浓度(1:100)对结核杆菌有抑制作用。煎剂(8%)水煎剂在体外对某些常见的皮肤真菌有不同程度的抑制作用。
3、其他作用 苦参碱注射于家兔：发现中枢神经麻痹现象，同生痉挛，终由呼吸停止而死。注射于青蛙：初呈兴奋，继则麻痹，呼吸变为缓慢而不规则，最后发生痉挛，以致呼吸停止而死。其痉挛的发作系起因于脊髓反射。
4、氧化苦参素碱的抗乙型和丙型肝炎病毒效应 氧化苦参素碱在体外和在动物模型中显示对HBV有强有力的抗病毒活性，在人体内同样具有抗HBV作用，已有不少的报道用于治疗慢性病毒性肝炎。 [2]

农业方面的应用
在农业中使用的苦参碱农药实际上是指从苦参中提取的全部物质，叫苦参提取物或者苦参总碱。近几年在农业上广泛应用，且有良好的防治效果，是一种低毒、低残留、环保型农药。主要防治各种松毛虫、茶毛虫、菜青虫等害虫。具有杀虫活性、杀菌活性、调节植物生长功能等多种功能[2]
苦参碱作为生物农药的特点：
首先苦参碱是一种植物源农药，具有特定性、天然性的特点，只对特定的生物产生作用，在大自然中能迅速分解，最终产物为二氧化碳和水。 其次苦参碱是对有害生物具有活性的植物内源化学物质，成分不是单一的，而是化学结构相近的多组和化学结构不相近的多组的结合，相辅相成，共同发挥作用。 第三，苦参碱因为多种化学物质共同作用，使其不易导致有害物产生抗药性，能长期使用。 第四，对相应的害虫不会直接完全毒杀，而是控制害虫生物种群数量不会严重影响到该植物种群的生产和繁衍。这种机理和在化学农药防护副作用凸显后经过几十年研究得出的综合防治体系中有害生物控制的原则是十分近似的。 综上四点可以说明苦参碱与一般高毒、高残留的化学农药有着明显区别，是十分绿色、环保的。[2]

基本信息
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通用名称: 苦参碱(matrine)。
别名：母菊碱、苦甘草、苦参草、苦豆根、西豆根、苦平子、野槐根、山槐根、干人参、苦骨
商品名称: 绿宝清、百草一号、绿宝灵、维绿特、碧绿
毒性: 为低毒杀虫剂。原药大鼠急性经口、经皮 LD50 均>5000mg/?。对动物和鱼类安全。
提取来源: 苦参碱是由豆科植物苦参Sophora flavescens Ait的干燥根、植株、果实经乙醇等有机溶剂提取制成的， 是生物碱，一般为苦参总碱，其主要成分有苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱等多种生物碱，以苦参碱、氧化苦参碱含量最高。其他来源为山豆根Sophora subprostrata (shandougen)，以及Sophora alopecuroides地上部分
外观：苦参碱纯品为白色粉末。
常用制剂： 0.3% 苦参碱水剂、1% 苦参碱醇溶液、0.2% 苦参碱水剂、1.1% 苦参碱粉剂、1% 苦参碱可溶性液剂。
产品特点及防治对象： 苦参碱是天然植物性农药, 对人畜低毒, 是广谱杀虫剂，具有触杀和胃毒作用。对各种作物上的黏虫、菜青虫、蚜虫、红蜘蛛有明显的防治效果。[2]

化学成分
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国外早在30年代初苏联开始研究，国内开始于1972年，国内外研究的重点均放在生物碱上，目前国内自苦参植物中提取、分离、鉴定的生物碱主要有氧化苦参碱(oxymatrine,C15H24N2O2),苦参碱(Matrine,C15H24N2O),异苦参碱(Iosmatrine,C15H24N2O),羟基苦参碱(sophor-anol),槐果碱(Sophocarpine,C15H22N2O)、氧化槐果碱(N-oxysophocarpine,C15H22N2O2),槐胺碱、槐啶碱(Sophoridine,C15H24N2O)、苦豆碱(Aloperine),金雀花碱(sparteine),N-甲基金雀花碱(N－methylcytisine),安那吉碱(anagyrine),膺靛叶碱(bap-iifoline)、脱氢苦参碱(sophocarpine),d-苦参碱(d-Matrine),d-异苦参碱(d－isomatrine),d-氧化苦参碱(d-Oxymatrine),l-臭豆碱(l-Anagyrine),l-甲基金花碱(l-Methyleytisine),l-穿叶赝靛碱(Baptifoline),苦参啶(kurarid-in),槐醇(Sophoranol, C15H24N2O2),氧化槐醇碱(SophoranholN-oxide,C15H24N2O3),N-甲基野靛碱(N-methylcytisine,C12H16N2O),等生物碱。
黄酮类化合物： 苦参所含黄酮类化合物多为二氢黄酮及二氢黄酮醇类，亦有黄酮，异黄酮，查尔酮等，从总黄酮分离的黄酮类化合物见下表：去甲苦参酮(降苦参酮,norkurarinone,C25H28O6)、苦参啶醇(kuraridinol),苦参醇(kurarinol),新苦参醇(neo－kurarinol),去甲苦参醇(norkurarinol),异苦参酮(isokurarinon,C26H30O6)；高丽槐素(maackiain，C16H12O5)；4-甲氧基高丽槐素(4-methoxy-maackiain,C17H14O6)；三叶豆紫檀甙(trifolirhizin,C22H22O10)；降脱水淫羊藿素(nor-anhydroicaritin,C20H18O6)；槐属二氢黄酮B(sophoraflavanone B,C20H20O5)；芒柄花素(formoronetin,C16H12O4)；黄腐醇(Xanthohumol)，异黄腐醇(Isoxanthohunol)，3，4`5-三羟-7-甲氧-8-异戊烯基山柰酚(3，4`5-Tri-7-Meth-8-prenylkeamferol；)等。茎、叶含木犀草素－7－葡萄糖甙(Luteolin-7-glucoside).
脂肪酸和挥发油：从苦参中已鉴定出20种脂肪酸成份，主要为不饱和脂肪酸，其含量占脂肪酸总量的72.79%，其中亚油酸相对含量为48.95%，苦参挥发油已鉴定出47个成份。[2]

与广豆根的区别
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广豆根描述
广豆根：Radix Sophorae Subprostrata
药材名：广豆根 Subprostrate Sophora Root
植物别名：山豆根、小黄连。
来源名称：为豆科物柔枝槐sophora subprostrata Chun et T.Chen的根。
植物形态：灌木，高1～2m。羽状复叶互生，小叶11～17，卵形或长圆状卵形，长1～2.5cm，宽0.5～1.5cm，顶瑞一小叶较大，上面疏生短柔毛，下面密生灰棕色短柔毛；小叶柄短，被毛。总状花序顶生及腋生，有毛；花萼阔钟形；花冠蝶形，黄白色；雄蕊10；子房密生柔毛，花柱弯曲，柱头上簇生长柔毛。荚果连珠状。花期5～6月，果期7～8月。
生长分布：生于石灰岩山地或岩石缝中。主产广西。
生物性状：根茎呈不规则结节状，顶端残留茎基或茎痕，下面着生根数条。根长圆柱形，略弯曲，长10～35cm，直径0.3～1.5cm；表面棕色至棕黑色，有纵皱纹及横长皮孔。质坚硬，断面皮部淡棕色，木部黄白色。微有豆腥气，味极苦。
广豆根主要化学成分：含苦参碱(matrine),氧化苦参碱(0xymatrine),N-甲基金雀花碱(N-methylcytisine),安那吉碱(Anagyrine),广豆根素(Sophoranone),环广豆根素(Sophoranochromene),广豆根酮(sophoradin),紫檀素(pterocarpine),高丽槐素(maackiain)等。
苦参和广豆根的成分共性：均含有如下生物碱：含苦参碱(matrine),氧化苦参碱(0xymatrine),N-甲基金雀花碱(N-methylcytisine),安那吉碱(Anagyrine).
苦参碱和氧化苦参碱(Matrine and oxymatrine)是两种从苦豆子根部发现的生物碱，主要植物来源为苦参(Sophora japonica (kushen)),也可以从其他的植物中提取，比如山豆根Sophora subprostrata (shandougen)，以及Sophora alopecuroides地上部分。苦参碱在1958年首次被分离和确认，是一类独特的生物碱(喹里西啶生物碱，也称羽扇生物碱tetracyclo-quinolizindine alkaloids),(查看Figure 1) 存在于Sophora类植物中，主要用来治疗癌症，病毒性肝炎，心脏病(例如病毒性心肌炎)，以及皮肤病牛皮癣和湿疹(psoriasis and eczema).
苦参素(Matrine,Sophocarpidine)是氧化苦参素碱(Oxymatrine)和极少量氧化槐果碱的混合物。
苦参碱 Matrine(Sophocarpidine)：本品系从豆科属植物苦参(Sophora flavescens Ait.)或平科植物广豆根(Sophora subprostrata Chun et T.Chen)中分离出来的生物碱。
性状:甘参碱是白金雀儿碱(lupanine)的异构体，有四种形态：
a－苦参碱为针状或柱状结晶，熔点为76度；
B－甘参碱为斜方晶状Prismatic crystal ，熔点为87度；
r－苦参碱为液体，沸点为223度；
&－苦参碱是柱状结晶，熔点为84度。
常见的是a－苦参碱，苦参碱能溶于水、苯、氯仿、甲醇、乙醇，微溶于石油醚。
氧化苦参碱分子式为C15H24N2O2.H2O，分子量为282
氧化苦参碱(Oxymatrine)：本品系从豆根槐属植物苦参(Sophra flavescens Ait.)或豆科植物广豆根(Sophora subprostrata chrn et T.Chen)中分离出来的生物碱。性状:熔点207度，水合物熔点162－163度。溶于水、甲醇、乙醇、氯仿、笨，难溶于乙醚。[2]

苦参的用途和功能
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苦参的西方用途：苦豆子sophora植物的原植物和热水粗提物在西方应用历史已经有25年了。最初含有20%氧化苦参碱和苦参碱的苦豆子生物碱提取物由窗同药物研究所引进西方市场，形式为氧化苦参碱片in tablet form under the name Oxymatrine，1998年上市。其使用并无任何副作用。在中国，苦参生物碱通常采用注射形式，但在西方不接受该方法，而是采用口服形式。口服后，大部分的氧化苦参碱被转化成了苦参碱；而如果需要氧化苦参碱的高血液浓度，则必须依靠注射。但是临床试验中氧化苦参碱的疗效是否好于苦参碱不得而知。中国的研究者们也使用片剂的苦参生物碱，效果似乎和注射差不多。苦参也可以作为中药煎服。
苦参中含有大量的生物碱，其中含量最高的是苦参碱和氧化苦参碱，加总占苦参药材根干总重的2%(其中大部分以氧化苦参碱的形式存在)，同时还有其他的相近的生物碱：其中主要是槐果碱(Sophocarpine,C15H22N2O)，还含有少量的槐醇sophoranol,槐胺sophoramine,槐啶碱(Sophoridine)allomatrine, 异苦参碱(Iosmatrine)等其他生物碱成分。(see Figure 2).这些成分最初在1958~1978年间从苦参中发现。
[2]

药理作用
1.利尿作用: 苦参煎剂:含之苦参碱给兔口服注射，皆可产生利尿作用，尿量增加前既有盐分排出之增多。但实验中所用家兔之数目较少，又未叙述饮水控制之情况，因而有人认为需进一步研究.
2.抗病原体作用:
煎剂在试管中，高浓度(1：100)对结核杆菌有抑制作用。煎剂(8%)，水煎剂在体外对某些常见的皮肤真菌有不同程度的抑制作用。
3.其他作用:
苦参碱注射于家兔，发现中枢神经麻痹现象，同生痉挛，终由呼吸停止而死。注射于青蛙，初呈兴奋，继则麻痹，呼吸变为缓慢而不规则，最后发生痉挛，以致呼吸停止而死；其痉挛的发作，恐系起因于脊髓反射。对家兔的最小致死量为0.4克/公斤.
4.氧化苦参素碱的抗乙型和丙型肝炎病毒效应.
氧化苦参素碱在体外和在动物模型中显示对HBV有强有力的抗病毒活性，在人体内同样具有抗HBV作用，已有不少的报道用于治疗慢性病毒性肝炎。
中国的临床医学研究报道:苦参素注射液治疗了64例慢性乙型肝炎患者并与a-干扰素进行了比较，苦参素治疗3个月(600mg次/日×45日，然后400mg次/日×45日)后，慢性肝炎的一般羡如乏力、纳差和腹胀消失比例均在90%左右，部分患者肝、脾肿大亦有不同程度回缩(分别是非曲直2.63%和38.1%)。另外对外周血白细胞减少和血小板减少尚有一定的升高作用。对肝功能的改善作用良好，而丙氨酸转氨酶(ALT)和血清总胆红素(SB)的复常率达81.6%和69.9%，HBeAg和HBV DNA阴转率(Negative Change Rate)分别为44.4%和45.3%，而干扰素治疗后HBeAg和HBV DN A阴转率分别为46.0%和48.0%，苦参素与a-干扰素相比并无差异，表明苦参素注射液治疗慢性乙型病毒性肝炎的疗效比较理想。本研究中，整个疗程中除少数患者肌注局部有轻度疼痛外，未见其它不良反应，表明苦参素注射液有安全性，此研究仅是近期疗效，究竟其远期疗效如何，尚待作进一步研究。
中国的临床医学研究显示:苦参素每日一次，每次肌注600mg39例乙型肝炎患者治疗12周后，HBeAg和HBV DN A阴转率分别为44.4%和50.0%，肝功能ALT和AST治疗后有明显改善，其总有效率为70.0%，结果显示苦参素有抗HBV及降酶作用。同时有良好的安全性和耐受性，无毒副反应。
Another Case:传染病医院报道:苦参素治疗42例慢性乙型肝炎患者，结果显示，苦参素治疗后一般症状如纳减、乏力的复常率为94.4%，肝区痛及腹胀的复常率为100%。部分患者肝、脾肿大亦有不同程度回缩(分别为30.0%和30. 3%)，对外周血红蛋白、白细胞及血小板的减少，有一定的升高作用。苦参素对ALT、AST、SB的复常率为71.4%、61.9%、和100% HBeAg和HBV DN A阴转率分别为50%和30.8%，与对照组相比具有显著性差异.
苦参素各种制剂均可以改善慢性乙型肝炎病人的肝功能，提高HBeAg和HBV DNA阴转率，停药后仍有持久疗效。
苦参素除了有抗HBV作用外，近来初步研究亦显示其对HCV亦有抑制作用。
中国的临床实验结果：用苦参素每日一次，每次600mg肌注治疗17例慢性HCV感染患者，经治疗后血清HBV DN A转阴8例47.1%。对照组18例患者血清HBV DN A转阴1例(5.6%)。两组比较有显著性差异，苦参素治疗组治疗后第1、2个月末血清ALT复常率均高于对照组，结果表明苦参素有抑制HCV增殖的作用，其HBV DN A转阴率接近国外重组成a-2b干扰素.因此，苦参素有望成为抗HCV的有效手段之一。
从目前的研究推测苦参素抗HBV和HCV作用机理可能为：
1）氧化苦参碱诱导细胞内某种物质(如干扰素等细胞因子)的产生，从而加强了HBV和HCV基因产物的降解；
2）氧化苦参碱的化学结构与嘌呤的结构类似，它在细胞或体内可干扰HBV和HCV机理还有待于深入讨研究。
6. 抗肝纤维作用 Against Liver Fibrosis
氧化苦参碱能抑制胶原活动度和防治肝纤维化
中国的临床实验结果：采用四氯化碳(CCL4)造成大鼠慢性肝损伤纤维化模型，同时采用Oxy防治，并动态观察血清丙氨酸转移酶(ALT)、IV型胶原(IV-C)、透明质酸(HA)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的水平以及肝脏组织病理变化，通过计算机图象分析系统，分析肝内纤维组织增生情况，结果表明，Oxy治疗组血清 ALT、IV-C、HA、TNF-α水平和肝组织内炎症活动度以及纤维组织增生程度均低于模型组，且大剂量治疗组又低于小剂量治疗组，表明Oxy有减轻肝脏炎症活动度，抑制肝内胶原合成及抗肝纤维化作用。
中国的临床实验结果：以NIH3T3成纤维细胞为靶细胞，应用MTT法、Northern blot杂交及免疫细胞化学技术，研究发现当Oxy浓度大于62.5 ug/ml时，成纤维细胞增殖活性受到明显抑制，并呈剂量依赖性，受抑制的细胞体积小、细胞质少，多呈梭状或圆形，细胞核小，处于核分裂期细胞少。Oxy并能明显抑制成纤维细胞III型前胶原mRNA及转化生长因子 (TGF-β1)的表达，提示以上发现可能是Oxy抑制肝纤维化的机理之一。
7. 对免疫系统的调节作用
关于氧化苦参碱对免疫功能的影响，有不同的报道。一般认为，它是一种双向免疫调节剂，在其低浓度时可刺激淋巴细胞增殖，高浓度时则抑制之。但总的来说，以免疫抑制作用为主。
临床实验表明：有研究发现氧化苦参碱对肺癌、胃癌细胞诱导的血管内皮细胞增殖具有抑制作用，表明氧化苦参碱有可能成为防治肿瘤转移的治疗药物。
8、其它方面:
氧化苦参碱抗过敏、抗炎作用：
氧化苦参碱具有抗过敏、抗炎作用：能调节免疫和升高白细胞。近年有研究发现Oxy和苦参碱Mat有抗过敏作用，可抑制炎症介质的释放，可调节小鼠和大鼠腹腔肥大细胞组织胺释放，可有效抑制IgE交联及组胺、白三烯等介质释放，并具有稳定细胞膜作用。另有报道Oxy 100 mg·；kg-1可提高肝微粒体细胞色素P450含量，可激活细胞膜上的腺苷酸环化酶，从而提高细胞内cAMP水平，Oxy 100 mg/kg时对大鼠产生强烈的利胆作用，这种作用可能同升高细胞内钙水平有关。Oxy对免疫系统细胞增殖的影响同细胞状态密切相关，升高白细胞作用及抑制自身免疫可应用于自身免疫性肝炎及白细胞及血小板减少的治疗。
9、苦参碱在农业上的应用：
苦参碱是由中草药苦参的根、茎、叶果实经乙醇等有机溶剂提取制成的，是生物碱，一般为苦参总碱，成分主要有苦参碱，氧化苦参碱、槐果碱，氧化槐果碱、槐定碱等，以苦参碱、氧化苦参碱的含量最高。 苦参碱是天然植物农药，害虫一旦触及本药，即麻痹神经中枢，继而使虫体蛋白质凝固，堵死虫体气孔，使害虫窒息而死，本品对人畜低毒，是广谱杀虫剂，具有胃毒和触杀作用。符合农业可持续发展方向，目前国内苦参碱制剂有0.3%苦参碱水剂、0.8%苦参碱内酯水剂、1%苦参碱溶液、1.1%苦参碱溶液、1.1%苦参碱粉剂等，这些植物源药剂已应用在防治蔬菜、果树、茶叶、烟草等作物一些害虫取得良好防效。
对蔬菜刺吸式口器昆虫蚜虫、鳞翅目昆虫菜青虫、茶毛虫、小菜蛾，以及茶小绿叶蝉、白粉虱等都具有理想的防效。另外对蔬菜霜霉、疫病、炭疽病也有很好的防效。值得关注开发。
[2]

防治的主要害虫
1.各种松毛虫、杨树舟娥、美国白娥等森林食叶害虫在 2-3 龄幼虫发生期，用 1%苦参碱可溶性液剂1000-1500倍液均匀喷雾。
2.茶毛虫、枣尺蝶、金纹细蛾等果树食叶类害虫用1%苦参碱可溶性液剂 800-1200倍液均匀喷雾。
3.菜青虫：在成虫产卵高峰后7天左右, 幼虫处于2-3龄时施药防治, 每亩用0.3%苦参碱水剂500-700 毫升，加水40-50千克进行喷雾。本品对低龄幼虫效果好，对4-5龄幼虫敏感性差。
注意事项 严禁与碱性药混用，本品速效性差，应搞好虫子情预测预报，在害虫低龄期施药防治。[2]

实验室分析
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方法名称： 复方蟾酥胶囊-苦参碱的测定-薄层扫描法
应用范围： 本方法采用薄层扫描法测定复方蟾酥胶囊中苦参碱的含量。
本方法适用于复方蟾酥胶囊中苦参碱的含量测定。
方法原理： 供试品碱化后，氯仿提取，蒸干氯仿，加乙醇定容，点样、分离，用薄层扫描仪进行扫描，用可见检测器，λS：530nm，测定苦参碱的峰面积，计算出其含量。
试剂： 1.苯，2.冰醋酸，3.乙醚，4.甲醇
仪器设备：
1 薄层扫描仪：
1.2 薄层板，含0.2%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G板；
1.3 可见检测器
2 色谱条件
2.1 展开剂：甲苯 丙酮 乙醇 浓氨水(20：20：3：1)，上行展开，展距7cm。
2.2 显色：显色剂为碘化秘钾试液，至显橙红色斑点后，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定后扫描。
2.3扫描参数：单波长反射式锯齿形扫描，λS：530nm；Sx=3。
3. 索氏提取器
试样制备： 1. 对照品溶液的制备，精密称取苦参碱对照品10mg，置于10ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
3. 供试品溶液的制备
取本品粉末约2g，精密称定。滴加氨水2 mL湿润，置索氏提取器内，用氯仿适量加热回流提取6 h，提取液转移置蒸发皿中，提取器用氯仿洗涤2次，每次5 mL，合并氯仿液，蒸干。残留物加乙醇溶解，定量移至5 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。
操作步骤： 苦参碱对照品溶液2ml，供试品溶液5ml，点在硅胶G板上。用甲苯 丙酮 乙醇 浓氨水(20：20：3：1)展开，采用薄层扫描法，λS：530nm，外标法定量，计算出苦参碱含量。

苦参提取物目前国内外研究最多是苦参碱,下面这篇文章你看一下有帮助吗?
苦参碱抗肿瘤作用及其机制的初步研究中华首席医学网 2007年11月01日 22:35:18 Thursday 点击次数：22
作者：马玲娣 张彦 文世宏 何於娟 刘小珊 康格非 蒋纪恺
作者单位：南京医科大学附属常州第二人民医院中心实验室，常州 213003
《中国免疫学杂志》2007年5月23卷5期 中医中药与免疫
加入收藏夹 【摘要】 目的：研究中药苦参碱（Matrine）的抗肿瘤作用及其免疫学机制。方法：MTT比色法检测肿瘤细胞的生长抑制率；流式细胞术分析细胞周期的改变。建立荷瘤小鼠模型，观察小鼠肿瘤的生长情况,计算肿瘤生长抑制率；MTT法测定苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖作用的影响；ELISA法检测苦参碱治疗后小鼠血清中IL�2和IL�12的活性。结果：苦参碱可显著抑制小鼠肿瘤细胞的体外分裂和增殖，且抑制作用呈浓度和时间依赖性，使G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，细胞增殖指数降低。苦参碱对小鼠实体瘤生长具有显著抑制作用，抑瘤率高达60.7%以上；明显抑制小鼠静止PBMC的体外增殖作用；不能提高荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12的含量。结论：苦参碱具有较强的抗肿瘤作用，体内体外却表现出一定的免疫抑制作用，提高机体的免疫功能不是苦参碱发挥抗癌活性的主要机制。

【关键词】 苦参碱；肿瘤；免疫调节

Preliminary studies on anti�tumor activies of matrine and its immunological mechanism

MA Ling�Di, ZHANG Yan, WEN Shi�Hong, HE Yu�Juan, LIU Xiao�Shan, KANG Ge�Fei, JIANG Ji�Kai.

The Central Laboratory, the Second Changzhou Hospital, Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Changzhou 213003, China

〔Abstract〕 Objective:To explore the inhibitory effects of matrine on tumor growth and the possible mechanisms related to immunological functions.Methods:The tumor cell growth repression rate was measured by MTT colorimetry. Flow cytometry was used to analyze the cell cycle of H22 cells. The H22 BALB/c xenograft tumor models were established. The anti�tumor effect of matrine was observed and tumor growth inhibitory rate(IR) was calculated. The effect of matrine on the proliferation of peripheral blood mononuclear cell(PBMC) separated from H22 tumor�bearing BALB/c was determined by MTT assay in vitro; the content of serum IL�2 and IL�12 were examined by ELISA assay.Results:Matrine inhibited proliferation of the H22 tumor cells in both time and concentration�dependent manners, with increased the cell numbers at G1 phase and decreased numbers at S and G/M phase showing the possible mechanism for lowering cell proliferation rate. The tumor inhibition rate of matrien came up to 60.7% in tumor�bearing mice. Matrine significantly suppressed the proliferative activity of PBMC from tumor�bearing mice. Furthermore, martine could not increase the contents of murine serum IL�2 and IL�12.Conclusion:Matrine could inhibit tumor cell growth directly but not exert the anti�tumor efficiency through reinforcing the immune function.

〔Key words〕Matrine；Tumor；Immunoloregulation

苦参碱是我国传统中药苦参中提取出的一种主要的活性成分，具有消炎抗菌、抗过敏、抗心率失常等多种药理学作用〔1，2〕。我们多年来的研究表明，苦参碱在体外可诱导人白血病细胞K562向正常形态分化，有效抑制K562细胞的体外增殖〔3，4〕。随着对苦参碱提纯和药效作用的深入研究，发现苦参碱还具有抗肿瘤作用，但目前对苦参碱抗肿瘤尤其是抗实体瘤方面的研究还不够深入，其体内外的抗肿瘤机制仍不明了，尤其是与荷瘤机体免疫功能之间的关系还是未知。为了认识苦参碱抗癌作用的机理和特点，我们选用小鼠H22肝癌细胞为研究对象，建立荷H22肝癌移植瘤小鼠模型，观察了苦参碱对H22细胞的抑制作用和其对荷瘤小鼠免疫功能的影响，以期探讨苦参碱抑瘤作用与机体免疫功能之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

苦参碱购自陕西省科学院西安植物园植物化学开发研究所，纯度为99.9%；RPMI1640培养基Gibco公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；刀豆蛋白A(Con A)及MTT〔3�(4,5)�双甲基�2�噻唑�(2,5)�二甲基溴化四氢唑盐〕均为美国Sigma公司产品；小鼠淋巴细胞分离液：天津灏阳生物制品科技有限责任公司出品；IL�2和IL�12 ELISA kit购自广州晶美生物过程有限公司；环磷酰胺（CTX）为上海华联制药有限公司产品，200 mg/支，批号000211；H22腹水型小鼠肝癌细胞由重庆医科大学基础医学院病理生理教研室惠赠；SPF级BALB/c小鼠，重庆医科大学实验动物中心提供；96孔细胞培养板：丹麦Duke公司；CO2培养箱：德国Heraeus公司；光学显微镜：日本Olympus；酶联免疫吸附检测仪美国Bio�Rad MODEL550型；电子数显游标卡尺：广州一途电子有限公司YT�203型。

1.2 方法

1.2.1 苦参碱对H22细胞生长的影响

收集对数生长期H22细胞，调整浓度为5×104 ml-1，接种于96孔细胞培养板中，每孔200 μl，实验分为实验对照组（只加试剂）和阴性细胞对照组（只加RPMI1640培养液）。实验组中加入终浓度分别为0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 mg/ml的苦参碱。每种浓度均设8个平行孔。培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中常规培养44小时后，离心弃上清，各孔均加入RPMI1640 200 μl，5 mg/ml MTT溶液20 μl，继续培养4小时，离心弃上清，加入二甲基亚砜200 μl，振荡器上振荡5分钟溶解蓝色结晶，混匀后以酶标仪于570 nm处读取各孔吸光度值（A570），计算肿瘤细胞的生长抑制率。

细胞生长抑制率(%)=1-实验组A570均值对照组A570均值×100%。

1.2.2 苦参碱对H22细胞周期的影响

取对数生长期H22细胞，调整浓度为3×105 ml-1/20 ml，接种于100 ml细胞培养瓶中，加入苦参碱，使其终浓度分别为0.5、1.0和1.5 mg/ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养48小时后收获细胞，PBS洗涤2次，70%冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶（PI）室温染色30分钟后，经流式细胞仪检测细胞周期时相分布，计算细胞增殖指数（PI）。

PI(%)=S+G2/MG1+S+G2/M×100%。

1.2.3 荷H22肝癌移植瘤小鼠模型的建立

对数生长期H22细胞，以RPMI1640调整细胞浓度为5×106 ml-1，于BALB/c小鼠左侧下腹部行无菌皮下接种，接种量为0.2 ml细胞悬液，细胞总数为1×106个。接种24小时后称重分组，将BALB/c小鼠随机分为4组：苦参碱高浓度组（Mhigh）和低浓度组（Mlow），给药量分别为50 mg/kg体重和100 mg/kg体重；阳性对照组给予20 mg/kg体重的CTX；阴性对照组（N.S control）给予等量无菌生理盐水。每组小鼠20只，每日以腹腔注射（i.p）方式给药，0.2 ml/只，隔日1次，连续注射7天。

1.2.4 苦参碱对H22荷瘤小鼠移植瘤生长情况的影响

停药后次日处死小鼠，剥出瘤体称重，计算肿瘤生长抑制率(IR)。

抑瘤率（%）=对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重对照组平均瘤重×100%。

1.2.5 苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖反应的影响

1.2.5.1 小鼠外周血单个核细胞(PBMC)的分离〔5〕
BALB/c小鼠颈椎脱臼致死，无菌取脾，盛有无菌Hanks液的平皿中轻轻捻碎脾组织，以250目不锈钢筛网过滤，收集得到脾细胞悬液。用小鼠淋巴细胞分离液按常规方法操作，分离得到小鼠PBMC悬液。台盼蓝染色计数活细胞数95%以上，以含10%胎牛血清的RPMI1640配成1×106 ml-1细胞悬液。

1.2.5.2 苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖反应的影响〔6〕

试验组为含有5 μg/ml ConA的小鼠PMBC悬液，内加入不同浓度的苦参碱溶液，使其终浓度分别为100、200和500 μg/ml。阳性对照组仅含5 μg/ml ConA，空白对照组为加入等体积PBS溶液。将上述细胞悬液分别加入到96孔细胞培养板中，每孔200 μl，试验组和对照组均设6个复孔(n=6)。加好样品的96孔培养板置于37℃、5%CO2的孵箱中培养72小时, MTT法步骤同前述。根据以下公式计算刺激指数(SI)：

SI(%)=实验孔A570均值对照孔A570均值×100%。

1.2.6 苦参碱对荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12水平的影响〔7〕

各组小鼠停药后次日摘眼球放血，静置后离心(3 000 r/min，10分钟)分离血清。ELISA法检测荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12的活性。

1.2.7 统计学处理

实验数据以x±s表示，多组间差异性比较采用方差分析（one way ANOVA），使用SPSS 10.0统计学软件进行分析。

2 结果

2.1 苦参碱对H22细胞生长的抑制作用

0.2 mg/ml苦参碱作用于H22细胞48小时后，细胞生长被抑制2%左右，0.5、1.0、1.5和2.0 mg/ml苦参碱均可显著抑制H22细胞的增殖，生长抑制率分别为15%、54%、86%和92%，且抑制作用呈剂量�效应依赖性，见表1，提示苦参碱可直接杀伤体外培养的H22细胞，具有较强的细胞毒作用。表1 苦参碱对H22细胞的增殖抑制作用（略）

2.2 苦参碱对H22细胞细胞周期的影响

0.5、1.0和1.5 mg/ml苦参碱作用48小时后G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，作用具有明显的剂量依赖性，见表2，显示苦参碱可有效抑制细胞周期的正常转换，使细胞在G1期堆积，细胞阻滞于G2/M期，从而阻止细胞的有丝分裂，使细胞增殖受到抑制。表2 不同浓度苦参碱对H22细胞周期的影响（略）

2.3 苦参碱对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用

苦参碱处理组小鼠的瘤体体积分别为（10.00±3.8）mm3和（12.19±5.4）mm3，明显小于N.S对照组小鼠瘤体体积（40.04±9.7）mm3，成瘤时间也明显晚于N.S对照组；50 mg/kg和100 mg/kg剂量苦参碱的抑瘤率分别为60.71%和63.53%，明显高于对照组（P0.05)，见图1。

2.4 苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖反应的抑制作用

苦参碱单独作用时，明显抑制小鼠静止PBMC的体外增殖，SI小于PBS对照组（P<0.01），对ConA活化了的小鼠PBMC增殖表现出一定的协同刺激作用，但刺激作用随苦参碱浓度的增高而降低，见表3。表3 苦参碱对小鼠PBMC体外增殖活性的影响（略）

2.5 苦参碱对荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12水平的影响

苦参碱治疗后，血清中IL�2和IL�12的水平没有明显改变（P>0.05），提示苦参碱不能促进荷瘤小鼠合成和分泌IL�2和IL�12，见表4。表4 苦参碱对荷瘤小鼠IL�2和IL�12水平的影响（略）

3 讨论

本研究中，我们通过体内外实验观察了苦参碱对小鼠H22肝癌细胞的作用，发现苦参碱作用后H22细胞分裂相减少，胞内颗粒明显增多，大量空泡出现，显示出较强的细胞毒性。苦参碱对H22细胞的增殖抑制作用具有时间和浓度的依赖性，低浓度苦参碱对H22细胞的抑制作用不明显，而0.5 mg/ml及更高浓度的苦参碱则可使细胞数量明显减少，增殖受到明显抑制。此外，苦参碱可使G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，细胞阻滞于G1→S期；细胞增殖指数降低，与细胞增殖抑制试验的结果相一致，表明苦参碱可以影响肿瘤细胞内DNA的复制和合成，抑制细胞的正常分裂；抑制细胞进入S期，从而使细胞在G1期堆积，出现G2/M阻滞，从而抑制细胞的增殖〔8〕。

苦参碱对小鼠H22实体瘤的生长也有明显的抑制作用，抑瘤率达60%以上。实验过程中发现，给以苦参碱治疗的部分小鼠给药后15天始终未形成明显的肿瘤结节，仅在接种处的皮肤表面出现紫红色溃疡性结痂，另有部分小鼠实验初期出现了肉眼可见的皮下肿块，但随着治疗的进行，肿块逐渐缩小至不见；苦参碱治疗后的小鼠，皮下瘤块的出现时间也普遍晚于对照组1～2天, 肿瘤生长速度也明显减慢，表明苦参碱能显著抑制小鼠肿瘤的发生和发展。由于实验中采用的是经腹腔注射的全身给药方式，可以排除苦参碱局部用药产生的毒性作用，表明苦参碱的抑瘤作用是通过机体自身的抗肿瘤机制起作用。

本研究发现，苦参碱不管是对荷瘤小鼠静止PBMC以及ConA活化了的PBMC的体外增殖反应都具有一定的抑制作用，显示了苦参碱在抗肿瘤同时，对免疫功能有一些抑制作用〔9，10〕。抗肿瘤免疫应答反应中，IL�2和IL�12是调节机体细胞免疫功能的两种重要的细胞因子，但本研究结果显示，苦参碱作用前后，小鼠血清中IL�2和IL�12的水平无明显改变，提示苦参碱对小鼠的抗肿瘤细胞免疫应答反应没有明显促进作用〔11〕。

以上研究结果表明，苦参碱对肿瘤所致的小鼠免疫功能低下状态没有明显改善，体内体外实验中都显示出了一定的免疫抑制效应，其抗肿瘤作用主要不是通过提高机体的免疫功能来实现的，还存在有其他的作用机制。

【参考文献】
1 肖培根. 新编中药志 〔M〕. 北京：化学工业出版社, 2002：555�561.

2 刘 梅，刘雪英，程建峰.苦参碱的药理研究进展 〔J〕. 中国中药杂志，2003;28（9）：801�804.

3 Zhang Y，Jiang J K，Liu X S et al. Differentiation and apoptosis in K562 erythroleukemia cells induced by matrine 〔J〕.Natural Medicine，1998;52(4):295�298.

4 Zhang L P，Jiang J K，Tam J W et al. Effects of matrine on proliferation and differentiation in K562 cells 〔J〕. Leuk Res，2001;25(9)：793�800.

5 沈关心，周汝麟. 现代免疫学实验技术 〔M〕. 武汉：湖北科学技术出版社, 2002:396�398.

6 杨 镇. 肿瘤免疫学 〔M〕. 武汉：湖北科学技术出版社, 1998:31�64.

7 金伯泉.细胞和分子免疫学 〔M〕.第2版.北京：科学出版社，2001：475�479.

8 司维柯，尚桃元，康格非. 苦参碱对人肝癌细胞HepG2的细胞形态学影响和相关增殖因素的变化 〔J〕.第三军医大学学报，2000;22(6)：553�556.

9 毛慧生, 刘洪隐, 李 川 et al. 苦参碱对肿瘤细胞恶性表型及免疫功能的调控作用 〔J〕. 中国肿瘤临床, 1996; 23(11): 799�803.

10 冯亚珍，周 蓉，李秀枝 et al. 苦参碱调节免疫功能的实验临床研究进展 〔J〕. 中华实验和临床病毒学杂志，1996;16(5)：308�310.

11 曹雪涛. 白细胞介素2的基础与临床 〔M〕. 北京：北京科学技术出版社, 1990：80�98.

方法名称： 复方蟾酥胶囊-苦参碱的测定-薄层扫描法
应用范围： 本方法采用薄层扫描法测定复方蟾酥胶囊中苦参碱的含量。
本方法适用于复方蟾酥胶囊中苦参碱的含量测定。
方法原理： 供试品碱化后，氯仿提取，蒸干氯仿，加乙醇定容，点样、分离，用薄层扫描仪进行扫描，用可见检测器，λS：530nm，测定苦参碱的峰面积，计算出其含量。
试剂： 1.苯，2.冰醋酸，3.乙醚，4.甲醇
仪器设备：
1 薄层扫描仪：
1.2 薄层板，含0.2%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G板；
1.3 可见检测器
2 色谱条件
2.1 展开剂：甲苯 丙酮 乙醇 浓氨水(20：20：3：1)，上行展开，展距7cm。
2.2 显色：显色剂为碘化秘钾试液，至显橙红色斑点后，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定后扫描。
2.3扫描参数：单波长反射式锯齿形扫描，λS：530nm；Sx=3。
3. 索氏提取器
试样制备： 1. 对照品溶液的制备，精密称取苦参碱对照品10mg，置于10ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
3. 供试品溶液的制备
取本品粉末约2g，精密称定。滴加氨水2 mL湿润，置索氏提取器内，用氯仿适量加热回流提取6 h，提取液转移置蒸发皿中，提取器用氯仿洗涤2次，每次5 mL，合并氯仿液，蒸干。残留物加乙醇溶解，定量移至5 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。
操作步骤： 苦参碱对照品溶液2ml，供试品溶液5ml，点在硅胶G板上。用甲苯 丙酮 乙醇 浓氨水(20：20：3：1)展开，采用薄层扫描法，λS：530nm，外标法定量，计算出苦参碱含量。

15870746075：苦参碱的实验室分析
殷钢雪 ：答：2.2 显色：显色剂为碘化秘钾试液，至显橙红色斑点后，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定后扫描。2.3扫描参数：单波长反射式锯齿形扫描，λS：530nm；Sx=3。3. 索氏提取器试样制备： 1. 对照品溶液的制备，精密称取苦参碱对照品10mg，置于10ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释...

15870746075：苦参碱液相色谱分析条件
殷钢雪 ：答：苦参碱液相色谱分析条件如下：1、样品处理：将苦参提取出来，并再次纯化、稀释。2、色谱条件：采用反相液相色谱分离技术，C18色谱柱作为分离柱，乙腈-水溶液为移动相，流速为1mL/min。3、检测条件：采用紫外光谱检测器进行检测，波长为270nm。4、标准曲线：制备浓度不同的标准溶液，根据其峰面积对应的苦参...

15870746075：牛乳中参碱如何测定
殷钢雪 ：答：4结果判断：乳中含有碱性物质时呈现粉红或红色，含碱量越大颜色越深，阴性为棕黄色（肉桂色）。发现阳性样品时，应送实验室进一步检测。5 试材配置：牛乳掺碱速测液10mL/1滴瓶，离心管10只，冲洗洁净后可反复使用。6 试剂效期：常温避光保存，有效期为1年。生产日期见包装标示。

15870746075：氧化苦参碱的沉淀反应实验原理
殷钢雪 ：答：氧化苦参碱的沉淀反应实验原理是，氧化苦参碱与浓硫酸发生氧化反应，生成红褐色的氧化碱的沉淀

15870746075：苦参碱(生物碱)生物碱提取物分离纯化注意事项?
殷钢雪 ：答：苦参碱属于一种生物碱，具有一定的生物毒性，可以用作杀虫剂的添加剂。通常我们从豆科植物苦参中进行天然提取；提取方式可以借鉴常规的植物提取物；在该产品的分离纯化方面需要主要好以下几个方面；1. 首先我们尽可能的要在源头上进行分析，检测把控、评估及成本核算。目的是选择出来适合于工业提取的原材...

15870746075：为什么苦参提取纯化实验中碱化树脂用具塞塑料试管
殷钢雪 ：答：关于为什么苦参提取纯化实验中碱化树脂用具塞塑料试管，我的看法是简化树脂，具有碱性，并且用塑料试管是为了防止碱性溶液，更好的进入塑料试管，而不会被碱性化腐蚀掉

15870746075：苦参的药理
殷钢雪 ：答：1、抗肿瘤作用：苦参碱具有抗癌活性，小鼠腹腔注射500µg.d组2mo存活率为40%，而对照组在23天内全部死亡。氧化苦参碱则对此无作用。苦参碱在体外具有降低小鼠腹腔巨噬细胞抑制P815肿瘤细胞增殖的效应。槐果碱（Sophocarpine）亦有抗癌活性，在实验小鼠体内对S-180、U-14.ECA、L等瘤株均表现...

15870746075：如何进行生物碱的分离
殷钢雪 ：答：以不同酸性缓冲液依pH由高至低依次萃取，生物碱可按碱性由强至弱先后成盐依次被萃取出而分离，分别碱化后以有机溶剂萃取即可。2、利用溶解度差异进行分离：利用氧化苦参碱极性稍大难溶于乙醚，苦参碱可溶于乙醚的性质，将苦参总碱溶于氯仿，再加入10倍量以上的乙醚，氧化苦参碱即可析出沉淀。

15870746075：盐酸滴定法测氢氧化钙到底测出来的是什么?
殷钢雪 ：答：自动电位滴定仪还能对滴定分析的各种测定参数,例如测定日期、仪器型号、滴定用标准溶液的消耗量、滴定曲线作自动记录,并自动计算打印出测定结果作为原始记录保存,减少了分析者原始记录数据处理的工作量和运算差错,提高了实验室间分析结果的可比性,有利于实验室管理,因此适于理化分析实验室用作代替人工操作的分...

15870746075：谁知道怎样提取含有硷的植物的碱份
殷钢雪 ：答：1.1.2 浸渍 浸渍法（maceration）可在常温或加热的条件下浸泡药材获取有效成分，操作简单易行，但所需时间长，溶剂用量大，有效成分浸出率低。常温浸渍是较为常用的生物碱提取方法，如秦学功等[7]考察了苦豆子种子中生物碱的冷浸工艺条件，室温下用稀盐酸提取苦豆籽中的苦参总生物碱，研究不同条件下...